O teste LAL: precauções a serem tomadas ao conduzir pesquisas em produtos farmacêuticos

Fonte: FUJIFILM Wako Chemicals USA Corp.

Por muitas décadas, descobriu-se que o método mais eficaz para determinar pirogênios em amostras farmacêuticas, independentemente da forma da substância ativa, é o teste LAL (Limulus Amebocyte Lysate). Usando o teste LAL, a presença de endotoxinas bacterianas, moléculas de lipopolissacarídeos (LPS) que fazem parte da parede celular das bactérias Gram-negativas, que são os pirógenos mais comuns e também os mais perigosos presentes nos produtos da indústria farmacêutica, é determinado.

O método LAL surgiu como um teste qualitativo da presença de endotoxinas. O gel que se forma a partir da coagulação da hemolinfa do caranguejo-ferradura ao entrar em contato com o LPS serviu de sinal analítico para os pesquisadores que desenvolveram o método. Ao longo dos anos, o uso do teste LAL foi se desenvolvendo, com a introdução de diferentes formas de fazer medidas de forma quantitativa. Atualmente, é possível adquirir os kits para realização do teste, utilizando métodos de detecção como o método colorimétrico e turbidimétrico. Os exemplos desses kits são distribuídos pela empresa Wako por meio de sua linha Pyrostar, como o Kit Limulus Color KY e o PYROSTAR ™ ES-F / Plate.

Para realizar o teste LAL, e conseguir que o erro na taxa de recuperação de endotoxinas seja mínimo, você deve levar vários cuidados em consideração. Algo muito importante a se ter em mente é a onipresença das bactérias Gram-negativas, que podem ser encontradas em quase todos os ambientes, por isso as fontes de contaminação a que os comprimidos estão expostos são diversas. As endotoxinas bacterianas podem vir tanto do pessoal quanto dos equipamentos em contato com as amostras, como o meio ambiente ou as matérias-primas utilizadas nos processos de fabricação. Em laboratórios de pesquisa, onde diversas linhas de estudo estão abertas em muitas ocasiões, pode haver contaminação cruzada em geladeiras onde as amostras são armazenadas, bancadas ou instrumentos de laboratório. Para minimizar o risco deste tipo de contaminação, utensílios e reagentes livres de endotoxinas bacterianas,

Deve-se notar também que, de acordo com o tipo de bactéria de onde provém a endotoxina, a molécula do LPS muda e nem todas são reconhecidas com a mesma taxa de recuperação. Dependendo do antígeno O que faz parte da estrutura do LPS e do grau de acilação da molécula, a hidrofobicidade da molécula muda. Portanto, não atuam da mesma forma em procedimentos de detecção que são realizados com diluições, por exemplo. Além disso, a distribuição das cargas no LPS varia e isso acarreta diferentes efeitos eletrostáticos que influenciam os processos de reconhecimento. A natureza da endotoxina também pode variar devido à adaptação da própria bactéria; para alcançar maior proteção em situações de estresse, um mecanismo de defesa da bactéria pode ser alterar a estrutura dos LPS que estão moldando sua membrana.

Todos os aspectos considerados acima afetam o grau de detecção das endotoxinas em um teste de LAL, quando da realização de análises de uma amostra farmacêutica ou de outra natureza. Os pesquisadores precisam verificar se os resultados não são falsos, pois às vezes o uso de soluções padrão de endotoxina como padrões pode levar a erros nas medições. Não se pode presumir que as endotoxinas mascaradas, quer pela formação de conjuntos supramoleculares, quer por outros fatores, não causarão danos aos organismos vivos. Todos os cuidados tomados no desenho dos testes usando o método LAL são necessários para garantir a confiabilidade dos resultados.