Princípios nos quais se baseia o teste Limulus para a detecção de endotoxinas bacterianas

Fonte: FUJIFILM Wako Chemicals USA Corp.

O teste LAL ou Limulus é usado para a determinação de endotoxinas bacterianas em uma ampla variedade de amostras em laboratórios de pesquisa e indústrias. O princípio deste teste é baseado no processo de coagulação que ocorre na hemolinfa do caranguejo ferradura (Limulus Polyphemus) na presença de lipopolissacarídeos. Neste artigo, é descrito o processo biológico e a forma como foi utilizado para desenvolver o teste.

A coagulação da hemolinfa do caranguejo-ferradura ocorre por meio de uma série de reações em cadeia semelhantes às observadas em mamíferos. Para que essas reações em cadeia sejam ativadas, as pró-enzimas serina protease presentes na hemolinfa precisam reagir sucessivamente para causar o processo de gelificação. Uma característica significativa das reações de coagulação que ocorrem no caranguejo Limulus é que elas são ativadas com quantidades muito pequenas de lipopolissacarídeos (LPS); as concentrações de endotoxinas bacterianas que entram em contato com a hemolinfa no nível do picograma já são suficientes para que as reações ocorram. Essas reações têm a função de imobilizar microrganismos patogênicos, que morrem devido a substâncias antimicrobianas secretadas em paralelo e liberadas na hemolinfa.

O fato de muitos dos precursores necessários para a formação de coágulos na hemolinfa do caranguejo-ferradura serem encontrados na hemolinfa na forma de grânulos, conhecidos como amebócitos, foi utilizado pelos pesquisadores para desenvolver um método de análise de endotoxinas bacterianas por extração a hemolinfa do caranguejo. Este teste é conhecido como Limulus Amebocyte Lysate (LAL), uma vez que o lisado dos grânulos é realizado precisamente para que reajam à presença de endotoxinas no ambiente de teste e a gelificação seja produzida. A gelificação é o sinal analítico usado para a detecção qualitativa e quantitativa de LPS. Para a realização do teste, uma quantidade da hemolinfa de cada caranguejo é extraída com uma seringa e o animal é deixado em seu ambiente.

DESTACADO: A detecção de endotoxinas por meio do teste LAL, o método do coágulo em gel

Se entrarmos mais no processo biológico que ocorre na hemolinfa do caranguejo-ferradura na presença de LPS, podemos ver vários processos de ativação separados de pró-enzimas para enzimas proteolíticas: - LPS ativa a reação do fator pró-enzima C autocataliticamente em sua transformação em fator C ativado; - O fator C, por sua vez, ativa o fator B; - O fator B transforma a pró-enzima formadora de gel em uma enzima. A enzima de coagulação resultante é responsável por ancorar as duas unidades peptídicas no coagulogênio, formando um gel insolúvel. Esta molécula é semelhante ao fibrinogênio em artrópodes.

A cadeia de coagulação descrita acima também é ativada pelo (1,3) -β-D-glucano, neste caso pela ativação do fator G, que é outra serina protease pró-enzima e que também leva à formação do gel -formadora de enzima. Portanto, o β-D-glucano é considerado um agente interferente no teste LAL para a medição de endotoxinas. Os pesquisadores Wako estudaram se a interferência do (1,3) -β-D-glucana é eliminada quando o curdlan é adicionado ao ambiente onde o teste de endotoxina é realizado com o método LAL. Na Divisão LAL da Wako , o curdlano carboximetilado é adicionado à mistura de reagentes liofilizados preparados para testes, como no caso do teste ES-F de Limulus e da série Pyrostar PS, garantindo resultados confiáveis ​​para a determinação de LPS.

Podemos confirmar que o teste LAL é um método de teste simples e muito sensível às endotoxinas bacterianas, e que atualmente é utilizado como o teste mais eficiente para a determinação dessas substâncias. O método original costumava ser feito de forma qualitativa ou semiquantitativa: a presença de endotoxinas era determinada pela leitura da formação do coágulo de gel após a incubação de uma amostra com lisado de amebócito a 37ºC por 1 hora. Atualmente, métodos quantitativos altamente eficientes que nos permitem saber a quantidade exata de endotoxinas bacterianas em uma amostra têm sido desenvolvidos, como o teste Limulus Color KY , que é baseado no método colorimétrico.

Bibliografia:

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